Signal Transduction Education
Active Learning Projects - Gleevec Project - Group 3

Groupe 1   Groupe 2   Groupe 3   Groupe 4   Groupe 5   Instructions du Projet

1. Définition générale de la leucémie myeloïde chronique 2. Etiologie et cytogénétique de la leucémie myeloïde chronique 3 Principes généraux de signalisation cellulaire et voies affectées par Bcr-Abl 4. Développement et mode de fonctionnement de Gleevec 5. traitement de la leucémie myeloïde chronique Instructions du Projet

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Sommaire:
I- Introduction
II- La cellule, unité de l'être vivant et intéraction avec son environnement
III- Caractéristiques des cellules cancéreuses
IV- Les voies affectées par la protéine Bcr-Abl

Auteurs: Nadia Chouaib, Baptiste Coutaud, Julien Gibon et Julie Janvore (rédactrice) Etudiants du module BCP608 "signalisation cellulaire", Université Bordeaux-1, Mai 2006.

Après une présentation détaillée de la maladie au niveau de l'organisme (groupe 1) puis au niveau chromosomique (groupe 2), nous allons voir les phénomènes observés au niveau cellulaire. D'abord, nous verrons comment les cellules, unités fonctionnelles de tout être vivant, peuvent communiquer entre elles et avec leur environnement afin de coordonner le bon fonctionnement de l'organisme entier. Pour cela, elles sont capables d'envoyer, de recevoir et d'intégrer des signaux particuliers: c'est la transduction du signal. Nous verrons ensuite comment une dérégulation de ce système peut entraîner un cancer, et dans le cas de la CML les perturbations apportées par Bcr-Abl.

L'organisme humain peut se décomposer en niveaux qui sont tous en inter-relation par l'intermédiaire de molécules. La communication entre tous les niveaux du corps humain est essentielle à sa survie, tout dérèglement peut être à l'origine de graves complications. Le cancer est une maladie de la signalisation cellulaire affectant directement la communication entre la cellule et l'organisme. Observons tout d'abord les niveaux qui composent un organisme humain.

Le niveau chimique est le plus élémentaire de l’organisme, il comprend tous les atomes et molécules essentiels au maintien de la vie (carbone, hydrogène, oxygène, azote, phosphate, calcium, sodium, potassium....). Certains de ces atomes se combinent pour former des molécules telles que les protéines, les glucides, les lipides et les nucléotides.

L'association de ces molécules nous ammène au niveau cellulaire (voir figure 1 ci-dessous). Les cellules sont les unités structurales et fonctionnelles de base de l'organisme. Il existe de nombreux types cellulaires : les cellules musculaires, nerveuses, sanguines, neuronales... Chacun de ces types cellulaires a une structure différente et une fonction différente mais tous sont essentiels au maintien de l'être en vie.

Figure 1 (cliquez sur l'image pour agrandir)

S'ensuit le niveau tissulaire, constitué d'un groupe de cellules semblables dont l'ensemble remplit une fonction précise. Il y a 4 grands types de tissus : épithélial, musculaire, conjonctif et nerveux.

Nous avons ensuite le niveau organique, les organes sont des structures composées d'au moins 2 tissus différents. Les organes remplissent une fonction physiologique précise. Le coeur, le foie, les poumons, le cerveau et l'estomac sont parmi les organes les plus importants de l'être humain.

Nous possédons ensuite le niveau systémique, il est composé de l'association de plusieurs organes qui forment ce que l'on appelle un appareil et cet appareil est à l'origine d'une grande fonction de l'organisme. Par exemple, l'appareil digestif est composé de la bouche, du pharinx, de l'oesophage, de l'estomac, de l'intestin grêle et du gros intestin. Le tout sert à la digestion.
L'organisme représente toutes les parties du corps qui fontionnent en inter-relation.

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1) La cellule dans son environnement

La cellule est la brique élémentaire de l'organisme. C'est l'unité vivante qui peut fonctionner en autonomie la plus petite. Elle joue donc un rôle fondamental dans la construction et la survie de celui-ci. Mais il faut également que la cellule soit à l'écoute de son environnement et puisse répondre correctement aux besoins de l'organisme. Il s'établit alors un respect bilatéral où l'organisme se tient informé de l'état de ses cellules, et où la cellule répond aux signaux de son environnement.

De plus, une cellule n'est jamais seule, isolée ou détachée, sauf pour les cellules circulantes. En effet, elles sont toujours attachées à leur substrat (matrice extracellulaire) ou aux cellules voisines. Elles baignent dans des centaines de facteurs solubles d'origine endocrine, paracrine ou synaptique, et reçoicent également les facteurs de la matrice extracellulaire, ou encore ceux fixés sur les cellules voisines. Elles doivent répondre sélectivement à ce brouhaha de signaux. Sur des milliers de combinaisons possibles, un nombre limité de combinaison de signaux peut être intégré par un type de cellules, comme un message spécifique de survie, de division ou de différenciation. En l'absence de tout signal, la cellule active un programme de suicide et s'autodétruit: c'est la mort cellulaire programmée ou apoptose.

Figure 2 (cliquez sur l'image pour agrandir) version Power Point

2) La communication avec son environnement

Une membrane biologique est la barrière mécanique fondamentale à l'échelle cellulaire. C'est une barrière protectrice et isolante, plus ou moins imperméable selon le type de membrane. La membrane plasmique définit l'entité cellulaire alors que les membranes subcellulaires permettent la compartimentation des différents organites de la cellule. L'imperméabilité de la membrane plasmique est nécessaire à l'intégrité de la cellule. Cependant, il faut qu'elle mette en place des mécanismes permettant la communication avec son environnement.

Ce processus permettant la communication est la transduction du signal. Ceci comporte deux dimensions: à la fois transmettre le signal d'un point de vue de l'espace physique (faire passer le signal de l'extérieur de la cellule vers l'intérieur), et à la fois traduire ce signal, c'est-à-dire comprendre le message puis modifier le comportement de la cellule en fonction de l'information reçue. La réponse peut être alors immédiate, comme une sécrétion par exemple, ou à plus long terme, comme une modification de l'expression de certains gènes, aboutissant au changement de comportement. Ceci permet la plasticité de la cellule et donc son adaptation en fonction de son environnement.

La transduction du signal à travers la membrane se fait grâce à un récepteur membranaire qui fixe une molécule de signalisation extracellulaire appelée premier messager. Cette fixation induit un changement de conformation du récepteur, ce qui active une voie de signalisation intracellulaire. Cette voie fait intervenir une cascade de réactions entre plusieurs protéines de signalisation. Enfin, une ou plusieurs de ces protéines de signalisation intéragit avec une protéine cible, et la modifie pour faciliter le changement de comportement de la cellule.

Figure 3 (cliquez sur l'image pour agrandir) version Power Point

3) Les systèmes de contrôle

Les voies de signalisation ne sont pas linéaires mais organisées en réseau, avec des interconnexions entre elles. Tout comme une toile d'araignée, il y a de nombreux embranchements et points clés qui rejoignent les différentes branches. Ceci permet au système d'être robuste afin d'éviter au maximum les dysfonctionnements. Par exemple, en cas de problème dans une voie, une voie parallèle redondante permettra à l'information d'être quand même transmise. Des rétrocontrôles, c'est-à-dire une inhibition du signal par les protéines cibles activées par ce même signal, évitent que le système ne s'emballe. De plus, lors de la réplication de l'ADN, le génome est finement contrôlé afin de détecter et de réparer les erreurs qui peuvent survenir.

Malgré cela, il arrive en permanence que des cellules deviennent cancéreuses. Mais grâce à un contrôle très précis des cellules, celles-ci peuvent être éliminées avant qu'elles ne deviennent nuisibles. En effet, elles sont soit repérées puis éliminées par le système immunitaire, soit elles se détectent elles-mêmes comme défectueuses et se tuent par apoptose. Dans le cas d'un cancer, les cellules subissent beaucoup de mutations somatiques, et finalement le système de contrôle devient muté et inefficace. C'est alors un cercle viscieux où les cellules ne sont plus éliminées par le système immunitaire, où elles ne sont plus sensibles à l'apoptose, et où le mécanisme de détection et réparation du génome est rendu inefficace, et donc finalement où les mutations sont de plus en plus nombreuses.

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1) Caractéristiques des cellules cancéreuses

La cellule cancéreuse (voir cellules du sang cancéreuses lors de la CML) possède de nombreuses caractéristiques qui la rendent différente d'une cellule normale (voir cellules du sang normales). Ces caractéristiques sont dues à des anomalies moléculaires, d'origine génétique ("génétique somatique"), donnant à la cellule tumorale un avantage sélectif et permettant sa croissance aux dépens des cellules normales. Ces anomalies moléculaires se manifestent par une morphologie et un comportement anormaux.

Au niveau de la morphologie cellulaire, les cellules cancéreuses se distinguent par des noyaux denses, foncés, globalement plus gros et de taille inégale d'une cellule à l'autre. La chromatine est anormalement répartie, en mottes. La membrane nucléaire est épaissie, les contours nucléaires sont irréguliers. Une cellule tumorale peut avoir plusieurs noyaux (multinucléation). Les nucléoles sont multiples, volumineux et irréguliers. Le nombre de mitoses est augmenté. Ces mitoses sont fréquemment anormales (tri- ou tétrapolaires). Le cytoplasme est moins abondant et il est basophile à cause d'une augmentation de son contenu en acides nucléiques. Il peut contenir des inclusions (par exemple des amas de filaments intermédiaires) et des vacuoles (de lipides ou de glycogène).

Au niveau de leur comportement, certaines modifications phénotypiques confèrent un avantage fonctionnel aux cellules cancéreuses. Leurs principales anomalies phénotypiques sont une perte de l'inhibition de contact, une perte de la dépendance vis à vis de l'ancrage, une hypersensibilité aux facteurs de croissance et surtout l'immortalité cellulaire.

De plus, les cellules cancéreuses se distinguent des cellules normales par quatre caractéristiques principales :

1. Une prolifération incontrôlée : La prolifération des cellules cancéreuses n'est plus régulée par les processus qui contrôlent normalement la division cellulaire et les processus de croissance tissulaire : il y a une perte de contrôle de la cellule par l'organisme. C'est la perte de régulation et non la vitesse de prolifération qui les distinguent des cellules normales.
2. Une perte de fonction : Dans le tissu sain, les cellules sont renouvelées à partir de cellules souches ; celles-ci vont donner naissance à des cellules filles qui se transformeront en cellules fonctionnelles du tissu correspondant par un processus de maturation post-mitotique. Une importante caractéristique des cellules cancéreuses est l'incapacité à effectuer leurs fonctions normales. Elles adoptent des fonctions totalement inappropriées.
3. Une invasivité (infiltration des tissus dans lesquels elles se developpent) : Les cellules normales, pendant leur différenciation, et les tissus sains, pendant leur croissance, entretiennent des relations structurelles stables entre eux, et ces relations sont maintenues en permanence, même lors des processus de réparation. Les cellules cancéreuses ne respectent plus les relations structurelles tissulaires et infiltrent puis envahissent les tissus voisins.
4. Une capacité à métastaser : On appelle ainsi les tumeurs secondaires formées par des cellules issues de la tumeur initiale, qui ont migré par voie sanguine ou lymphatique pour se développer dans des sites à distance de la tumeur mère.

2) Le cancer, une maladie de la signalisation cellulaire

Les mécanismes de cancérisation sont liés à des anomalies de la communication inter- et intra-cellulaire. Les grandes fonctions et en particulier la prolifération et la survie sont orchestrées par des signaux intracellulaires normalement très contrôlés et organisés en réseaux complexes. Lors d'un cancer, ces cascades de signalisation sont déréglées.

Les cellules transformées deviennent beaucoup plus sensibles aux signaux de croissance. Elles n'ont plus la nécessité d'être en relation forte avec d'autres cellules ou avec la matrice extracellulaire donc perdent leur dépendance à leur substrat et enfin, les cellules cancéreuses perdent leur sensibilité à l'apoptose (mort cellulaire programmée) donc deviennent immortelles.

La recherche a pu mettre en évidence que les cellules cancéreuses sont le plus souvent touchées sur des gènes codant pour des acteurs participant dans les voies de signalistaion cellulaire. Une stratégie de traitement possible serait de trouver le talon d'achille des cellules cancéreuses, c'est-à-dire bloquer par exemple une voie spécifique des cellules cancéreuses. On pourrait ainsi tuer ou bloquer la prolifération des cellules cancéreuses sans tuer les cellules saines.

Une cellule possède normalement une balance négative de prolifération, c'est à dire qu'elle ne prolifère pas sauf si un signal intervient pour enclencher tout le mécanisme de prolifération. Ce sont principalement les jonctions cellules-cellules qui permettent cette balance négative. La cellule est en homéostasie, en équilibre de survie.

Si la cellule, par des modifications de son génome (multiples mutations) vient à "gagner une fonction" (activation d'un gène prolifératif), il peut y avoir une balance positive aux signaux pouvant induire la prolifération cellulaire. Si au contraire la cellule "perd une fonction", et si cette fonction perdue était un tumeur suppresseur (gène anti-prolifératif), la balance devient positive et la prolifération non désirée par l'organisme peut avoir lieu. C'est l'équilibre des signaux qui permet l'intégrité de la cellule.

Il existe de très nombreuses voies de signalisations. Elles sont interconnectées et il est important de comprendre que la vie d'une cellule ne dépend pas de voies simples et linéaires. Ces voies forment des réseaux complexes assurant la survie de la cellule. Elles font intervenir des cascades de réactions où des protéines-kinase (cf. plus loin) sont phosphorylées pour être activées, pour ensuite phosphoryler à leur tour d'autres protéines-kinases. A la manière d'une chaîne de dominos, lorsqu'ils tombent les uns après les autres, ces cascades de réactions sont une suite de phosphorylations qui permettent au final de transmettre une information.

Dans le cas de la CML, le génome de la cellule est lourdement modifié avec l'appartion d'un chromosome de philadelphia, ce chromosome possède un gène chimère qui code pour une protéine chimère appelée Bcr-Abl. C'est une protéine kinase dérégulée qui est plus souvent sous sa forme active qu'inactive (gain de fonction), et qui va interférer avec des protéines de nombreuses voies de transduction du signal. Bcr-Abl va complètement désordonner le système de signalisation intracellulaire sur plusieurs voies. Elle va agir en phosphorylant certains effecteurs de ces voies, elle va servir de lieu de fixation d'autres effecteurs et enfin, elle va modifier les propriétés d'adhésion cellulaire et donc perturber la transmission des signaux antiprolifératifs.

Les voies touchées sont : la voie RAS, la voie PI3K, la voie JAK/STAT et la voie Rho.

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Avant d'étudier en détail les voies de signalisation affectées par Bcr-Abl et pour bien comprendre le résultat de l'effet de cette protéine kinase dérégulée, expliquons ce que sont les protéines kinases de manière générale.

Prérequis: Les protéines kinases

Les kinases sont des enzymes qui catalysent la réaction d'attachement d'un goupement phosphate (H2PO3- ) sur une protéine. Les kinases elles-mêmes sont souvent activées par la phosphorylation de leur segment d'activation ( T-loop ). L'ajout d'un phosphate sur ce segment entraîne un changement de conformation de la protéine kinase. En effet, le groupement phosphate H2PO3- amène des charges négatives, entraînant une répulsion électrostatique, conduisant à l'écartement du segment de l'activation de quelques Angströms. Cet écartement permet de liberer le site actif de tout encombrement stérique, libérant l'accès au substrat. La kinase peut alors phosphoryler son substrat. Ces enzymes sont essentielles aux cascades de signalisations intracellulaires et donc vitales pour l'organisme. Ces enzymes sont donc très régulées. Pour plus de détails sur la régulation et la dérégulation des protéines kinases, consulter le site du groupe 4 (groupe 4) .

Nous allons à présent décrire les quatre voies de signalisation afféctées dans la CML.

fig 4

1) La voie RAS

La protéine de fusion Bcr-Abl active la voie RAS, conduisant à l'expression anormalement élevée de gènes indispensables pour la prolifération cellulaire, tels que c-Fos (un facteur de transcription induisant la réplication de l'ADN), c-Myc (nécessaire pour la transcription de l'ARN ribosomale), ou c-jun. Cette voie active également la synthèse protéique en favorisant la traduction au niveau des ribosomes.

La protéine Bcr-Abl possède, sur sa partie Bcr, une Tyrosine phosphorylable, la Tyr177 ou Y177. Elle va permettre l'association avec une protéine adaptatrice Grb2 et ainsi de déclencher la voie RAS. En effet, Grb2 possède un domaine SH2 qui s'associe à la Tyr177 phosphorylée, et deux domaines SH3 qui s'associent à un domaine riche en Proline d'une autre protéine, SOS. Puis SOS va retrouver la protéine Ras qui se trouve à la membrane. Ras est une petite protéine G. Elle est associée à la membrane par une ancre lipidique, ne contient qu'une seule petite sous-unité et possède une activité GTPasique. SOS favorise l'échange d'un GDP contre un GTP dans la boucle effectrice de Ras. Ras-GTP active va alors s'associer avec un domaine Raf-RBD de la protéine Raf-1. Le recrutement à la membrane de Raf-1 permet l'activation de Raf-1. Raf-1 activée phosphoryle une autre protéine MEK. Puis MEK-P active va à son tour phosphoryler ERK. ERK est une protéine de la famille des MAP-kinase (Mitogene Activator Protein kinase, donc activant la mitose). ERK-P active se dimérise: chacun des deux monomères porte deux phosphates (Thr183 et Tyr185). Le dimère va ensuite être transloqué dans le noyau et phosphoryler des facteurs de transcription qui vont activer la transcription de certains gènes: p62TCF phosphorylé s'associe avec p67SRF, qui vont tous les deux se fixer sur une séquence de l'ADN, par exemple la séquence SRE (Serum Response Element) située sur le promoteur en amont du gène c-Fos.

figure 5

2) La voie PI3K

Cette voie est impliquée dans le rôle transformant de la protéine Bcr-Abl. Elle est l'une des voies responsables de la prolifération des cellules cancereuses et de la survie cellulaire.

Bcr-Abl forme des complexes avec la PI3-kinase, Cbl et les adaptateurs Crk et Crkl. Cbl est phosphorylée sur un résidu tyrosyl par Bcr-Abl et peut alors se lier au domaine SH2 de Crkl. Crkl est une protéine adaptatrice contenant des domaines SH2 et SH3. Les domaines SH3 des protéines Crk et Crkl lient Bcr-Abl.

Un des substrats de la PI3-kinase phosphorylée est la sérine-thréonine kinase : PKB/Akt . Lorsque cette dernière est phosphorylée, elle phosphoryle la protéine BAD.

Cette protéine est une molécule pro-apoptique qui a la capacité de se lier avec BCLX au niveau du domaine BH3 de BAD lorsque ce dernier se trouve à l’état déphosphorylé. Or dans le cas de la myéloide chroniques aigue, associée à la protéine de fusion Bcr-Abl, la protéine BAD est phosphorylée, elle est donc incapable de se lier aux protéines anti-apoptotiques BCLX. BAD est alors neutralisée dans le cytosol par une protéine chaperonne: 14-3-3, elle n'exerce donc plus de fonction pro-apoptotique. Il en résulte une inhibition de l’apoptose et donc une survie cellulaire.

figure 6

3) La voie JAK/STAT

La protéine de fusion Bcr-Abl se sert de la voie de signalisation appelée JAK-STAT pour influer sur des gènes favorisant le développement des cellules cancéreuses. La famille des JAK-kinases, composés de tyrosines kinases intracellulaires, et les protéines STAT sont impliquées directement dans la transduction du signal à partir des membres de la famille des récepteurs aux cytokines.

La cytokine induit en se fixant à son récepteur un rapprochement physique entre deux protéines accessoires (appelées gp130) qui servent d'intermédiaire. Les protéines JAK sont activées par autophosphorylation, elles changent de conformation induisant la phosphorylation des résidus Tyrosine des gp130. Ces protéines accessoires vont encore servir d'intermédiaire car ce sont elles qui attirent et amènent les protéines STAT jusqu'aux JAK. Les STAT phosphorylées se dimérisent et rentrent dans le noyau dans lequel elles jouent le rôle de facteur de transcription. Leur régulation s'effectue principalement dans le cytosol lorsque la protéine est encore inactive car les inhibiteurs bloquent son activité tyrosine-kinase en se fixant sur son site phosphorylable.

fig 7version Power Point

Dans les lignées Bcr-Abl positives, les protéines STAT 1 et STAT 5 sont tyrosines-phosphorylées de manière constitutive et leur activité de liaison à l'ADN est maximale. STAT 5 présente une activité anti-apoptotique en activant la transcription des gènes codant pour les protéines anti-apoptotiques BCLX.

4) La voie Rho

LBcr-Abl modifie les propriétés d'adhésion cellulaire.

fig 8

La protéine Bcr-Abl va phosphoryler un certain nombre de protéines agissant au niveau de l'adhésion cellulaire et notamment le FAK.

FAK est activé par les intégrines, les facteurs de croissance, certaines cytokines ou hormones, il en résulte une auto phosphorylation d'une tyrosine libérant ainsi un site de liaison pour la protéine Src. Il y a alors activation du complexe d'adhérence et transmission de signaux régulateurs pour la migration, la survie et la prolifération. FAK est donc indirectemment une protéine anti-apoptotique car son inhibition provoque la perte d'adhérence et donc l'apoptose.

Par phosphorylation, Bcr-Abl active FAK et les complexes d'adhérences. Il n'y a plus intervention des signaux extérieurs, les intégrines n'interviennent plus, la balance signalitique devient positive par gain de fonction, la cellule devient insensible à l'apoptose même si cette cellule perd le contact avec la matrice extra cellulaire.

De plus, Bcr-Abl active de petites protéines G de la famille rho : rho A, Rac1 et cdc42. Or ces protéines sont très impliquées dans la réorganisation du cytosquelette d'actine essentielle aux contacts cellule-matrice extra cellulaire. L'activation des protéines rho passe par les VAV (GEF) qui sont des activateurs de ces protéines. Bcr-Abl va former des complexe avec ces VAV et induire (par phosphorylation sur une tyrosine) l'activation des protéines G responsables du remodellage du cytosquellette d'actine. Voie de signalisation mettant en jeu VAV.

fig 9

fig 10

Après avoir décrit au niveau cellulaire les phénomènes observés lors de la pathologie de la CML, le groupe suivant va traiter de l'effet au niveau moléculaire de la dérégulation que produit Bcr-Abl, ainsi que les moyens utilisés pour limiter l'activité de Bcr-Abl et le développement d'un médicament, Gleevec®.

Références pour les illustrations:

1. "Biologie cellulaire et moléculaire", KARP, 2ème édition (2004), aux éditions De Boeck.
2. "Signal Transduction", GOMPERTS, KRAMER, TATHAM, édition Academic Press/Elsevier 2002.
3. Goldman, J.M. et al. N Engl J Med 2003; 349:1451-1464