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Active Learning Projects - Gleevec Project - Group 4    
 
gleevec
Groupe 1   Groupe 2   Groupe 3   Groupe 4   Groupe 5   Instructions du Projet
 
1. Définition générale de la leucémie myeloïde chronique
2. Etiologie et cytogénétique de la leucémie myeloïde chronique
3 Principes généraux de signalisation cellulaire et voies affectées par Bcr-Abl
4. Développement et mode de fonctionnement de Gleevec
5. traitement de la leucémie myeloïde chronique
Instructions du Projet

active learning, any time, any place and anywhere

4. Développement et mode de fonctionnement de Gleevec

Sommaire:
I - Régulation des kinases - Structure de c-Abl et régulation par auto-inhibition
II - Conséquences de la dérégulation - Rôles de Bcr dans la dérégulation
III - Quelles solutions pour maîtriser Bcr-Abl - Développement et mode de fonctionnement de Gleevec®

Auteurs: Pierre Alexis Cayatte, Nguyen Phuong Hoang, Diane Thibon et Paul Lesbats (éditeur) Etudiants du modules BCP608 "signalisation cellulaire", Université Bordeaux-1, Mai 2006.

I - Régulation des protéines kinases

reddot  Les protéines kinases (ou des kinases) sont des protéines qui ont pour vocation d'activer ou de désactiver d'autres protéines devant être régulées, lorsqu'elles en recoivent l'ordre, ou plus justement, "le signal". La modification réalisée par la kinase sur la protéine à réguler consiste en l'attachement d'un groupement phosphate (H2PO4- ) sur des acides aminés spécifiques, on parle ainsi de phosphorylation. Ces protéines activées par les kinases pourront par exemple, atteindre le noyau de la cellule, et ainsi y induire l'expression de gènes spécifiques (on parle de transcription de gènes). Cette expression induiera la synthèse de nouvelles protéines, comme les facteurs de croissance par exemple, ou pourra entraîner la cellule dans une nouvelle voie métabolique, et ce, en réponse au signal recu par la cellule et transmis à la kinase.

reddot  Les kinases apparaissent alors comme des protéines devant elles-mêmes être finement régulées car si celles-ci se retrouvaient continuellement actives, elles n'auraient de cesse d'activer ou de desactiver les protéines qu'elles régulent habituellement. Le système perdra sa plasticité, il ne répond plus aux besoins de l'organisme ou au besoins de la cellule elle même. Si ces protéines induisaient la synthèse de facteurs de croissance, cela pourraient alors conférer un profil cancéreux à la cellule. La régulation des kinases s'appuie sur de nombreuses interactions à l'interieur même de la kinase, entre les différents domaines la constituant. Nous verrons (figure 1 ci-dessous) l'exemple de la protéine kinase c-Abl (son activité kinasique dérégulée est responsable du developpement de la CML) afin d'illustrer la plasticité et la régulation des protéines kinases.

Figure 1. Abelson ou Abl est une protéine kinase constituée de plusieurs domaines jouant un role primordial dans sa régulation : deux domaines Src-homology, SH2 et SH3, ainsi que deux lobes constituant le domaine kinasique, un petit lobe N et un plus gros lobe C ; la partie N terminale de la proteine définit un Cap, permettant une interaction avec un groupe myristoyl (ou un groupe palmitoyl). Ce groupe peut également interagir avec un autre site d'ancrage et ce, dans le domaine kinasique de Abl. Il existe en outre dans ce même domaine un segment d'activation responsable de l'accessibilité ou non des substrats au site de phosphorylation. Enfin, il existe un linker entre le domaine SH2 et le lobe N du domaine kinase, les SH2-kinase linker.

reddot  Dans son état “normal”, Abl se trouve être dans un état inactif, à savoir un état fermé. Elle n’est pas alors en mesure de pouvoir phosphoryler de substrat. Cet état inactif est la résultante d’interactions propres à la kinase, qui mettent en jeu les domaines cités ci-dessus ; on parle alors d’autoinhibition. Cet état inactif, peut être compromis, en faveur d’un état actif, et ce, par l’intervention d’autres protéines, dont d’autres kinases, qui s’associeront à l’Abl, et viseront à la rouvrir, modifiant ainsi sa conformation, de sorte que son substrat et l’ATP puissent avoir un accès au site de phosphorylation. Le maintien de l’état inactif de la kinase, est un aspect primordial de la régulation, puisque si celle-ci se trouvait être active de façon constitutive, cela entraînerait de graves complications, telle la leucémie myéloïde chronique.

reddot  L’autoinhibition d'Abl est tout d’abord assurée par l’action d’un groupe myristoyl. Celui-ci est rattaché au domaine N terminal de la kinase, à savoir le domaine SH3 ; ce myristate trouve également un point d’ancrage réversible, au niveau d’une poche hydrophobe du lobe C du domaine kinase (voir figure 2 ci-dessous), formant ainsi un locquet, un verrou (voir figure 3, ci-dessous, situation kinase inactive à gauche). Ce verrou a pour conséquence de fermer la kinase, en induisant un « clamp » entre les domaines SH et les deux lobes du domaine kinase ; les domaines SH2 et SH3 se retrouvant alors respectivement très proches des lobes C et N du domaine kinase. D’autres interactions viennent stabiliser cette conformation fermée. En effet, le domaine SH3 interagit par sa région proline-like PXXP (où X peut être n’importe quels résidus) avec le SH2-kinase linker, qui adopte une conformation spatiale de type PXXP (sous forme d'hélice polyproline de type II) mais où en fait la dernière proline est remplacée par une tyrosine (motif PXXY).

figure 2. Le domaine SH2 interagit également avec le lobe C du domaine kinasique, par le biais de liaisons hydrogènes entre les résidus de l'hélice SH2 aA et aE du lobe C.

reddot  Le clamp ainsi créé, prévient la phosphorylation du segment d’activation, et ce, en le séquestrant, de sorte que la tyrosine 412 de ce segment ne soit pas accessible aux kinases ; ce segment d’activation lorsqu’il est non phosphorylé sur Y412 empêche l’accrochage du substrat de Abl et de l’ATP au niveau du domaine catalytique, grace à une conformation non adaptée, non reconnue par les deux substrats.

reddot  Au vue de toutes ces interactions, il est clair que l’activation de Abl mettra en jeu toutes sortent de réactions (protéines et kinases intervenant alors), qui viseront à rouvrir Abl. La première de ces réactions, consistera à déverrouiller le groupe myristoyl du lobe C, de sorte de pouvoir « declamper » les domaines SH du domaine kinasique. Ce déverouillage a pour conséquence la rotation d'une hélice a1' aidant alors au declampage entre les domaines SH et les deux lobes. La seconde réaction aura pour but de phosphoryler la tyrosine 245, contenue dans le motif PXXY. Une fois phosphorylée, la région proline-like du domaine SH3 ne reconnaîtra plus le motif PXXY et ainsi, s’en détachera. Ceci libére ainsi la place pour un (ou plusieurs) ligand contenant d’une part une région riche en proline, et d’autre part une tyrosine phosphorylée (il a par ailleurs été montré qu'un ligand avec un motif pTyr-Glu-Asn-Pro possédait une forte affinité pour les deux domaines SH), qui se fixeront respectivement au domaine SH2 et SH3, permettant ainsi l’ouverture de la kinase. Cette ouverture aura pour effet que le segment d’activation ne sera plus séquestré, et sera au contraire exposé à l’exterieur du domaine kinasique, conduisant alors à la possible phosphorylation de Y412, nécessaire à la fixation de l’ATP et du substrat de Abl, qui pourra ainsi être phosphorylé.

figure 3. Les différents états de la protéine kinase c-Abl

reddot  Puis des phosphatases interviendront afin de dephosphoryler Y412 et Y245 ; ainsi le clamp sera en mesure de se refermer, le myristoyl se reverrouillera au niveau de site du lobe C et ainsi la kinase redeviendra inactive. Le retour du clamp entraine également la rotation de l'hélice aC ayant pour effet de retirer les résidus catalytiques d'ATP et de substrat du site catalytique (site de phosphorylation), prévenant par la même occasion leur retour, et ce par encombrement stérique.

reddot  Il est possible de visualiser ici une animation résumant les évenements moléculaires pendant l'activation et l'inactivation de la protéine kinase c-Abl.

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II - Conséquences de la dérégulation

Pourquoi y a-t-il absence de régulation chez Abl-Bcr?

reddot  Comme il a été dit ici, les cellules souches dans la moelle osseuses porte une translocation entre le chromosme 9 et le chromosome 22 ce qui induit à l'expression d'une oncoprotéine. La protéine chimère comprend le premier exon de Bcr (acides aminés 1 à 426) et les acides aminés 27 à 1130 de Abl. Les acides aminés 1 à 63 de Bcr forment une séquence codante pour un domaine d'oligomérisation, quant à Abl sa séquence se voit tronquée du domaine "cap" et du groupement myristate, mais garde les domaines SH2, SH3, domaine kinase et domaine de fixation à l'ADN et au cytosquelette intacte (Voir figure 4 ci-dessous).

figure 4. la composition de la protéine chimère Bcr-Abl

reddot  La protéine de fusion ainsi produite à partir du gène Bcr-Abl, est une kinase échappant à toute régulation. En effet, comme il a été dit, la kinase endogène est régulée par un mécanisme d'auto-inhibition reposant sur trois mécanismes ; le "clamp SH2-SH3", le "SH2 kinase-linker" et le segment d'activation. Dans le cas de l'oncoprotéine Bcr-Abl plusieurs de ces mécanismes sont absents.

reddot  Tout d'abord la région de Bcr d'acides aminés 197-385 interagit avec le domaine SH2 empêchant ainsi la formation de la conformation "verrouillée" ("Latched"), inactive de la kinase. En effet comme il a été dit ci dessus, le domaine SH2 est impliqué dans l'autoinhibition de la kinase, en particulier dans le maintien de la forme non-phosphorylée du segment d'activation en cachant la tyrosine 412, par une interaction (liaison hydrogène) avec le lobe C. Ainsi la présence non souhaitée des résidus provenant de Bcr vont venir interférer sur cette intéraction indispensable au bon fonctionnement de la protéine kinase.

reddot  Ensuite la région de Bcr d'acides aminés 1-63 constitue un domaine enroulé d'oligomérisation, induisant à la fois des homotétramérisations et l'attachement de la kinase sur des filaments d'actines. Cette fixation au cytosquelette joue un rôle essentiel dans la capacité transformante de Bcr-Abl. De plus l'oligomérisation augmente énormément le potentiel de trans-phosphorylation de la la tyrosine 412 impliquée dans le déverrouillage du segment d'activation. La présence de la séquence Bcr perturbe également le transit de la proteine c-Abl.

reddot  Enfin la protéine Bcr-Abl ne possède pas de "domaine Cap", ni de groupement myristate, tous deux impliqués dans la bonne conformation verrouillée (inactive) de la protéine kinase. En effet, le "domaine Cap" est codé par le premier exon et une partie du second exon de Abl1; ainsi la fusion avec le gène Bcr induit la perte de ces séquences, entrainant donc la perte de ce "domaine Cap".

figure 5.La perte du domaine CAP et du groupement myristoyl dans la protéine chimère Bcr-Abl a pour conséquence que la protéine kinase ne peut plus se « verouiller ». Son activité augmente donc considérablement.

reddot  Ainsi, la translocation entre le chromosome 9 et 22 va induire la production d'une protéine kinase "anormale" dont la structure tridimensionnelle sera différente de la protéine endogène. Cette différence de structure aura comme conséquence directe, la perte d'interaction entre les différents domaine ayant un impact sur la régulation de cette kinase. Se trouvant dans une conformation activée la protéine va "s'emballer" guidant ainsi les cellules vers un phénotype cancéreux. Pour rétablir une bonne régulation il va falloir "jouer" sur certains mécanismes clés spécifiques des kinases tout d'abord et ensuite spécifique à Bcr-Abl.

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III - Quelles solutions pour maîtriser Bcr-Abl dérégulée

Développement et mode de fonctionnement de Gleevec

reddot  La découverte du chromosome Philadelphia et s'en suivant de la protéine Bcr-Abl (protéine à caractère oncogénique) remonte à 1982. Malgré cela, les thérapeutiques quant au traitement du CML n'en ont pas bénéficiée et ainsi aucun nouveau traitement s'est révélé être efficace. Jusque là les traitements ne ciblaient pas spécifiquement la protéine elle-même mais étaient plutôt destinés à détruire l’activité prolifératrice des cellules. Nous traitions ainsi les patients par des médicaments tels que le Bulsufan, l'Hydroxyura… et plus récemment avec l'IFN-a (Interferon a) ; mais ces médicaments ne connaissent pas un grand succès, elles connaissent en effet des problèmes d'efficacité liés à un faible taux de survie au cours du traitement ou, à un manque de spécificité à discriminer les cellules saines des cellules cancéreuses, ou encore, à un problème de toxicité élevée. Ainsi, ces résultats ne nous permettaient pas d'envisager de belles perspectives quant au traitement du CML. Il a donc fallu concevoir une autre façon de traiter la maladie et ce plus spécifiquement, plus efficacement et avec moins de toxicité. L'activité aberrante de la protéine kinase Bcr-Abl chez les patients atteints CML est alors apparue comme une cible thérapeutique « séduisante ».

reddot  Pour faire face à la leucémie myéloide chronique, plusieurs traitements (en plus de la chimiothérapie) agissant sur plusieurs niveaux, plus ou moins efficaces selon les cas et les stades de la maladie, ont été élaborés. Parmi eux, on trouve des molécules inhibitrices de la proteine kinase Bcr-Abl. Ces molécules auront pour rôle essentiel de s'intercaler dans la proteine de fusion de manière à rendre celle-ci inactive car inaccessible pour le substrat. On trouve parmi ces molécules inhibitrices, une petite molécule : le Gleevec, STI-571 ou encore appelée imatinib mesylate .Celle-ci est un dérivé du 2,phenylaminopyrimidine qui a une trés haute affinité et spécificité pour la tyrosine kinase Abelson (Abl) et est cliniquement un véritable succés dans le traitement des leucémies liées à Bcr-Abl, incluant plusieurs cas de CML et un sous ensemble de leucémie lymphoide aigue (ALL). Plus de 90% des patients atteints de CML en phase précoce, montrent une complète normalisation de la réponse hématologique aprés un traitement avec STI-571.

Développement

reddot  Lors de sa fabrication, le Gleevec n'était pas une molécule inhibitrice destinée à venir interagir avec la proteine fusion Bcr-Abl. Initialement le laboratoire Novartis avait établi une sélection aléatoire sur des inhibiteurs de la proteine kinase alpha (PKC-alpha). Il identifierent la classe des phenylamino-pyridine comme étant de bons inhibiteurs compétitifs de l'ATP se fixant sur les PKC. Par la suite, une équipe de chercheurs a modifié cette classe de composés montrant un haut niveau de spécificité, et a identifié un inhibiteur du récepteur de croissance tyrosine kinase (PDGF-R). Celui-ci supprime la croissance des tumeurs dans les lignées cellulaires où PDGF est activé. Etonnement, cet inhibiteur (CPG-53,671) ne supprime pas seulement l'activité de la tyrosine kinase PDGF-R mais inhibe également l'activité de la tyrosine kinase Bcr-Abl.

reddot  Les chercheurs ont alors essayé de comprendre ce fait, ils ont alors découvert que la séquence primaire de ces kinases n'était pas similaire. Ils ont alors compris qu’il fallait analyser la structure tridimensionnelle de ces kinases afin de mieux comprendre la spécificité des inhibiteurs. CPG- 53,671 a ensuite été optimisé de sorte d’être plus spécifique à la tyrosine kinase Bcr-Abl, ainsi l’Imatinib Mésylate est né.

Mode de fonctionnement

figure 6. L'analyse de la structure cristallographique du domaine kinase d'Abl complexée avec STI-571 (voir photo ci-contre), montre qu'il existe des liens avec la poche de liaison à l'ATP et que le gleevec force la boucle d'activation dans une conformation non phosphorylée inactive (voir animation). De plus, la structure montre comment le domaine kinase est inactivé.
En effet, le domaine kinasique d'Abl est inhibé par un changement conformationnel défini à la base de sa boucle d'activation. Le résidu asparate du motif DFG, participe à la coordination d'un ion Mg2+ (rôle dans la stabilisation des phosphates a et ß de l'ATP permettant la libération du 3ème phosphate) quand le domaine kinasique est actif, alors que quand le domaine kinase est inactif, le résidu asparate intervertit sa position avec le résidu phenylalanine du motif DFG et est ainsi retiré du site actif. Bien que visant la poche de liaison des nucleotides d'Abl, STI-571 est trés specifique et inhibe seulement deux autres tyrosines kinases : le PDGF-R (Platelet-derived growth factor) et c-Kit.

figure 7. Il existe ainsi une interaction entre le Gleevec et Bcr-Abl localisée au niveau du site catalytique. Cette interaction implique notament le résidu Y272 (visualisé ici où l'on voit le volume d'interaction entre cette tyrosine et le Gleevec). C’est une des 11 tyrosines importantes dans la régulation de la structure de Bcr-Abl. Ce résidu est localisé sur le P-loop, et entre normalement en contact avec le phosphate de l’ATP ; mais dans ce cas, la position de l’ATP est occupée par STI-571 (voir photo ci-contre) ; cette molécule empêche donc la fixation du substrat.

reddot  En somme STI-571 prend la place de l'ATP quand Bcr-Abl est inactive mais aussi lorsque Y272 est phosporylée, et ce, dû à une plus grande spécificité de STI-571 au site actif par rapport à l'ATP. Dans la structure d'Abl avec STI-571, Y272 contribue à une complémentarité entre la protéine Abl et STI-571 via les interactions Van Der Waals avec les cycles aromatiques de STI-571. En retour, le positionnement d’Y272 requière les liaisons hydrogènes avec N341, guidant ainsi le sous-repliement de P-loop. La conséquence de ce repliement est de rendre Abl dans sa conformation inactive, alors incapable de fixer le substrat. Sa position est extrêmement conservée dans la famille d’Abl, de C.Elegans aux Humains. La mutation de ce résidu Y272 par une phénylalanine dans Bcr-Abl chez les patients atteints de CML engendre la résistance au STI-571.

Des mutations en Bcr-Abl peuvent conduirent à la résistance contre
Gleevec (STI-571)

reddot  La résistance au STI-571 se produit à plusieurs niveaux, ce sont des mutations des acides aminés qui sont normalement en contact avec STI-571. Les figures 6 et 7 ci-dessus présentent les points de mutations dans la protéine kinase Bcr-Abl qui rendent la protéine résistant au STI-571. Ces mutations ont été découvertes chez les patients résistants au STI-571.

reddot  Mais les mutations des résidus dans les autres domaines d’Abl kinase (N-ter, C-ter, le Cap) ou les domaines SH2, SH3 qui ne sont pas en contact direct avec le STI-571 entrainent malgré tout une résistance au médicament. Ceci, car ces résidus sont importants dans le maintient de la protéine dans une conformation inactive après la fixation du STI-571.

reddot  Merci à Olivier Hantschel, CEMM, Vienna, Autriche pour les vidéos et à Bhushan Nagar pour les images. Codec Xvid pour les vidéos

 

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Last Updated December 6, 2006 11:33 PM | admin news