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Overview
Signal Transduction Education  
Active Learning Projects - Gleevec Project - Group 2    
 
gleevec
Groupe 1   Groupe 2   Groupe 3   Groupe 4   Groupe 5   Instructions du Projet
 
1. Définition générale de la leucémie myeloïde chronique
2. Etiologie et cytogénétique de la leucémie myeloïde chronique
3 Principes généraux de signalisation cellulaire et voies affectées par Bcr-Abl
4. Développement et mode de fonctionnement de Gleevec
5. traitement de la leucémie myeloïde chronique
Instructions du Projet

active learning, any time, any place and anywhere

2. Etiology and cytogenetics of chronic myeloid leukemia

Sommaire:
1) Rappel
2) Introduction génétique
3) Le Chromosome Philadelphia (Ph1)-: Une translocation réciproque "somatique"
4) Les techniques d’identification des anomalies génétiques

Auteurs: Bachir Kantana Zada, Karim Mansoury, Aurore Trocoli et Rémi Laporte (rédacteur) Etudiants du module BCP608 "signalisation cellulaire", Université Bordeaux-1, Mai 2006.

1) Rappel

reddot La leucémie correspond à une prolifération anormale ( non contrôlée ) d’un type de globules blancs (leucocytes). Une leucémie particulière, la CML ( chronic myelogenous leukemia) débute dans les cellules de la moelle osseuse appelées cellules souches, précurseur de tous les types de cellules sanguines. La CML est caractérisée par une translocation entre deux chromosomes ce qui ce traduit par la formation d'un chromosome anormalement petit et d'un chromosome anormalement grand. Le petit chromosome est appelé »Philadelphie« (Ph) car découvert par des chercheurs à Philadelphie (Etats-Unis). Ceci est confirmé par le fait que l’on retrouve ce chromosome chez plus de 90% des patients atteints CML.

Dans cette page nos expliquerons ce que sont les chromosomes et de quelle façon leur modification, par des translocations accidentelles entre le chromosome 9 et 22, peut avoir des conséquence néfastes telles une léucémie mortelle.

figure 1

reddot Le gène est caractérisé par sa longue sequence de nucléotides (ADN) qui constitu le support d'un message codé qui détermine la nature des protéines, c'est-à-dire le nombre, l'ordre et l'identité de leurs acides aminés.
Un nucléotide est composé de trois parties: un groupement phosphate, un sucre corespondant à un désoxyribose, et une base azotée purique (A ou G), ou pyrimidinique ( T ou C). La combinaison de trois bases code pour un acide aminé ou pour les codants stop UAG, UGA, UAA.
La longue séquence d’ADN liée à des protéines telles que les histones forme "la chromatine" que l'on trouve au niveau du noyau d'une cellule.

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2) Introduction génétique

Les chromosomes

reddot Ce sont de longues séquences d’acides nucléiques. Ils consituent le patrimoine génétique et sont composés de milliers de gènes (messages codés qui détermines la natures des protéines) et de longues séquences » non codantes «.

  1. support de l'hérédité (chromosomes maternel + chromosomes paternel)
  2. support de l'organisation de la vie cellulaire

reddot Le caryotype humain normal comporte 46 chromosomes qui portent environ 40 000 gènes:

  1. 22 paires d'autosomes, notés de 1 à 22 en fonction de leur taille décroissante
  2. 1 paire de gonosomes, ou chromosomes sexuels: XX chez le sujet féminin, XY chez le sujet masculin.

Les translocations ont normalement lieu uniquement pendant
la formation des gamètes

Au cours de la méiose, qui signe le début du processus de maturation des cellules germinales en gamètes, les chromosomes homologues de chaque paire s’apparient pour former des bivalents (ou tétrades). C’est au cours de cet appariement de chromosomes homologues que se mettent en place les crossing-over (échange du matériel) qui permettent des recombinaisons génétiques entre les génomes parentaux. Puis, les bivalents doivent se séparer pour que chacun des homologues migre dans une cellule fille différente. C’est cette étape critique de recombinaison et de séparation qui peut être altéré par l’existence d’une anomalie chromosomique et entraîner une mauvaise ségrégation des chromosomes homologues.

reddot Une translocation est caractérisée par deux cassures sur deux chromosomes différents, le plus souvent non-homologues, et un recollement après échange des segments distaux. On distingue deux formes majeures de translocations : les translocations robertsoniennes et les translocations réciproques. Ces translocations peuvent être équilibrées ou non équilibrées. Elles peuvent survenir de novo ou être transmises.

reddot Les translocations robertsoniennes se produisent entre chromosomes acrocentriques (13, 14, 15, 21 et 22) par fusion au niveau du centromere( entrainant un caryotype de 45 chromosomes.

reddot Pour la translocation réciproque il s'agit d'un échange de matériel entre deux chromosomes non homologues après cassure sur chacun des chromosomes impliqués. Si cet échange s'accompagne d'une perte de matériel génétique, il est déséquilibré, sinon la translocation est dite équilibrée.

reddot Les translocations réciproques peuvent intervenir à n'importe quel moment au cours de la vie et s'observent dans les processus cancéreux:

figure 2

reddot Le type alterné produit des gamètes normaux, ou porteurs équilibrés de la translocation parentale.

  • Le type adjacent 1 est fréquent: il associe un chromosome normal (ex; chromosome a) avec le remanié de l'autre paire (der(b)). Il y a alors "duplication-déficience": présence en excès d'une séquence et défaut d'une copie d'une autre séquence.
  • Le type adjacent 2 est très rare: il associe un chromosome normal avec son homologue remanié (ex: a + der(a)).
  • Le type 3:1 est rare: Soit un chromosome remanié est transmis avec les homologues normaux (ex: a, b, der(b)) dans une cellule fille, et l'autre remanié (der(a)) dans l'autre cellule; Soit un homologue normal est transmis avec les deux chromosomes remaniés (b, der(a), der(b)) dans une cellule, et l'autre chromosome normal (a) dans l'autre cellule). Contrairement aux cas précédents, les zygotes n'ont pas 46 chromosomes, mais 47 ou 45.

reddot De nombreuses mutations somatiques n'ont aucune conséquence sur l'individu porteur, car elles restent limitées à la cellule qui a subi la mutation et à ses éventuelles descendantes. Mais en ce qui nous concerne, la leucémie chronique est due à des translocations réciproques affectant les cellules souches lymphoides qui peuvent passer l'anomalie chromosomique à toutes les cellules sanguines qui en découllent.

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3) Le Chromosome Philadelphia (Ph1)-: Une translocation réciproque "somatique"

reddot Les translocations accidentelles peuvent aussi avoir lieu dans les cellules somatiques, c'est à dire les cellules qui constituent le corps et ne forment pas de gamètes. Un exemple est une translocation réciproque entre le chromosome 9 paternel et le chromosome 22 maternel. Cette translocation conduit à la formation de deux chromosomes aberrantes comme montre la figures 3 ci-dessous.

figure 3

reddot Au niveau des gènes, cette translocation crée un seul gène chimère (ou gène de fusion) (voir figure 3 ci-dessus). Le gène Abelson (ABL), situé sur le chromosome 9 est coupé en deux, ainsi que le gène BCR, situé sur le chromosome 22. Quand les morceaux de chromosomes s’échangent, le fragment coupé du gène BCR va se coller au morceau restant du gène ABL sur le chromosome 9, et de même, le morceau cassé du gène ABL va se coller au fragment restant du gène BCR sur le chromosome 22. On obtient donc sur le chromosome 22 un gène anormal chimère BCR-ABL formé du début du gène BCR et de la fin du gène ABL, et sur le chromosome 9 un gène anormal ABL-BCR, composé du début du gène ABL et de la fin du gène BCR. La transcription du gène chimère BCR-ABL produit une protéine chimère qui modifie le processus de production des cellules du sang (hématopoïèse) et "le timing" du mort programmée (voir figure 4 en-dessous). Les deux modifications donnent lieu à la leucémie et c'est pour cela qu'on appelle le gène chimère un oncogène (onco veut dire » tumeur «).

reddot Les causes de cette translocation ne sont pas totalement établies. La translocation en soit n'est pas hériditaire car elle ne se présente pas dans les gamètes. Cependant, il est possible qu’une descendance puisse hériter d’une prédisposition à cette translocation ou tout autre type de recombinaison génétique. Cette possibilité reste à étudier car a ce jour, aucune prédisposition génétique pour la CML n’a été mise en évidence.

figure 4

reddot Les protéines ABL et la protéine chimère BCR-ABL sont des protéines kinases, enzymes qui attachent un groupement phosphate à d’autres protéines au niveau de leur acide aminé tyrosine, dans le but de modifier leur activité. Par rapport à la protéine ABL, la chimère BCR-ABL échappe à la régulation de son activité. C’est son activité dérégulée qui accélère le processus de division cellulaire et protège également les cellules contre la mort cellulaire programmée (apoptose). Le résultat est une agumentation du nombre des cellules peu différenciées, les blastes, qui portent le chromosome Ph1.

reddot Différentes anomalies oncogéniques peuvent entraîner une transition de la phase chronique à la phase blastique. Dans le phase blastique de la maladie le nombre de blastes augmente considerablement et leur apparence sous la microscope est plus variable (pléiotrope). Plus de 80% des cas atteints de la CML en phase blastique sont porteurs d’aberrations génétiques suplémentaires (en plus du chromosome Philadelphia). Plusieurs événements oncogéniques sont associés à une phase blastique incluant; une trisomie du chromosome 8, la perte de la fonction de protéine p53, une amplification de l'expression de la protéine MYC, une perte our modifcation de la protéine RB1 et une perte/modification de la protéine p16INK4A.

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4) Les techniques d’identification des anomalies génétiques

reddot A chaque étape de la maladie, différentes techniques peuvent être utilisées pour identifier les anomalies du patrimoine génétique. Elles ont toutes une cible et une sensibilité différente. C’est pour cela qu’à chacun des différents stades de la maladie, telle ou telle technique sera utilisée.

Tableau 1 représentant les sensibilités relatives
des principales méthodes de détection de la maladie.

Méthodes Cibles Sensibilité
Cytogénétique conventionnelle Chromosome philadelphia 1-10
FISH Juxtaposition de BCR et ABL 0.2-0.5
Southern blot Rearrangement M-BCR 1-10
Western blot Protéine BCR_ABL 0.2-1
RT-PCR ARNm BCR-ABL 0.001-0.0001

Tableau 2 représentant les cibles et la sensibilité des différentes méthodes.

4-1) Le caryotype

reddot Sur des cellules en division (mitose) on effectue une carte du génome pour détecter toute anomalie des chromosomes : telle qu’une translocation ou bien une délétion d’un morceau du chromosome. Dans le cas de la CML, il y a translocation entre le chromosome 9 et le chromosome 22. Les personnes qui ont cette maladie se retrouvent avec un chromosome 9 plus long que la normale et un chromosome 22 plus court que la normale (chromosome Philadelphie). Ces deux chromosomes sont très visibles lorsqu’un caryotype est pratiqué sur les cellules atteintes de cette maladie (voir figure 5 ci-dessous).

reddot Pour établir ce caryotype, des cellules de la moelle osseuse sont prélevées et traitées de manière à colorer les chromosomes. Ensuite, les chromosomes sont classés selon leur taille. Pour savoir si le patient atteint de CML, on cherche à détecter ces deux chromosomes de taille anormale (voir figure 5 ci-dessous pour un caryotype d’une cellule saine et d’une cellule porteuse de la translocation).

reddot Si il l’est, ce caryotype permettra de déterminer à quel stade de la maladie il en est. Car en effet, quand le patient passe dans la phase accélérée de la maladie, on peut détecter d’autres anomalies comme des trisomies des chromosomes 8 et 22 avec une duplication du chromosome Philadelphie.

caryotype d'une personne saine caryotype d'une personne atteinte
figure 5

4-2) Les techniques FISH (Fluorescence In Situ par Hybridation)

reddot Dans cette technique, on effectue un marquage des gènes concernés dans la translocation. Pour cela, les mêmes opérations que dans la technique précédente sont effectuées à savoir une ponction de cellule dans la moelle osseuse, puis une coloration. Les gènes BCR et ABL sont alors marqués par des fluorochromes de couleurs différent. Si les deux gènes sont situés au même endroit (ce qui est le cas lors d’un gène chimère faute d'une translocation) une superposition des couleurs sera obtenue (rouge et vert devient jaune, voir figure 6 ci-dessous). Par contre, si la translocation n'a pas eu lieu, deux couleurs distinctes seront obtenues car les deux gènes seront situés sur deux chromosomes différents.

reddot Les sondes spécifiques BCR et ABL ont été choisies en fonction de leur position par rapport au point de cassure. Le diagnostic repose alors sur la fusion des spots du 9 et 22 sur le chromosome Philadelphie. Cette recherche ciblée peut s'appliquer sur les chromosomes métaphasiques mais aussi interphasiques, c'est-à-dire sur les noyaux cellulaires.

figure 6
Localisation du gène ABL sur les chromosome 9 (spot rouge), localisation du gène BCR sur le chromosome 22 (spot vert). Localisation du gène chimère BCR-ABL dans une cellule d’une personne atteinte de CML. Fusion du spot rouge et du spot vert (couleur jaune) due à une translocation et fusion des deux protéines.

4.3) PCR (polymerase chain reaction)

4.3.1) Les différents transcrits

reddot A travers la PCR, différents transcrits peuvent être mis en évidence. En effet, en fonction du point de cassure sur les gènes Abl et Bcr et de la fusion, différents transcrits seront obtenus. La plupart de ces cassures surviennent dans les régions introniques et offrent une grande variabilité dans les différents points de fusion. Ceci a pour conséquence une grande difficulté de détection à partir de l’ADN génomique. Il faut donc attendre que la transcription soit effectuée pour que l’épissage élimine les introns et raccroche ensemble les exons. On se retrouve alors avec différents ARNm.

reddot Le point de cassure du gène Abl se situe dans un segment de 300 kb entre les exons 1 et 2 coté 5’, à la fin du gène. Dans la grande majorité des cas, pour le gène Bcr, la cassure se situe dans une région de 5.8 kb connue sous le nom de »major breackpoint cluster«: M-Bcr. Dans cette région, on ne trouve que cinq exons (b1 à b5) qui correspondent aux exons 12 à 16 du gène Bcr.

reddot Lors de la fusion, il y a toujours perte de l’exon 1 de Abl, ce qui provoque une hyperactivité kinasique.

reddot Les transcrits de fusion les plus répandus sont:

  1. fusion entre l’exon 3 de Bcr et l’exon 2 de Abl (b3 a2)
  2. fusion entre l’exon 2 de Bcr et l’exon 2 de Abl (b2 a2)
  3. fusion entre l’exon 1 de Bcr et l’exon 2 de Abl (e1 a2)

reddot Les transcrits plus rares sont les suivants:

  1. fusion entre l’exon 2 de Bcr et l’exon 3 de Abl (b2 a3)
  2. fusion entre l’exon 3 de Bcr et l’exon 3 de Abl (b3 a3)

Tableau représentant les différents transcrits

4.3.2) La PCR

reddot La PCR consiste à amplifier l’échantillon de base. Pour cela, l’ADNc est dénaturé. Des amorces sont ajoutées et vont se fixer par complémentarité aux brins d’ADN. Va alors commencer la polymérisation. Il y aura de nouveau dénaturation puis polymérisation. L’échantillon à analyser sera alors amplifié de manière exponentielle. La dernière étape consistera à ajouter la sonde. Celle-ci va s’hybrider aux brins dénaturés et permettra de la repérer dans le gel.

Fig1 :Schéma représentant les zones d’hybridation
de la sonde et l’emplacement des amorces.

Fig: Gel d’agarose contenant des produits de PCR

  • puit1: l’échantillon contient la protéine b3a2....atteint de CML
  • puit2: l’échantillon contient la protéine b2a2....atteint de CML
  • puits3 et 4: aucune des deux protéines
  • puit5: l’échantillon contient les deux protéines....atteint de CML
  • puit B: contrôle négatif
  • puit M5: contrôle positif

4.3.3) PCR competitive

reddot La PCR competitive consiste à amplifier, dans le même tube, l'échantillon et une concentration connue d'un compétiteur (très proche du transcrit à amplifier, ne différant que par quelques bases qui permettent de les différencier). Lorsque la concentration de l'échantillon est proche de celle du compétiteur, les produits d'amplification, séparés par un gel, sont de même intensité, permettant ainsi de déduire la concentration dans l'échantillon. Cette technique, longue et difficile à appliquer en routine, a cependant permis de montrer l'importance des techniques quantitatives pour le suivi des patients sous interféron ou après greffe de mœlle.

fig: Gel d’agarose représentant une PCR compétitive

reddot On voit bien ici le rôle du compétiteur dans le déterminisme du taux de transcrit de BCR-ABL. On voit que la quantité de transcrit est approximativement 10^4.5 car cela correspond à 50% de compétiteur, 50% de transcrits.

4.3.4) PCR en temps réel (Real Time PCR)

reddot Par le fait qu’il y a augmentation de façon exponentielle des brins d’ADN seulement 5 à 10 ml de sang sont prélevés sur le patient. Ce procédé est très sensible.

reddot De ce sang, les ARNm sont purifiés et transcrits en ADNc par RT-PCR. Le taux de transcrits Bcr-Abl est déterminé par la méthode de PCR en temps réel.

reddot La technique la plus utilisée est la »balise moléculaire«:

Fig 1: balise moléculaire en forme de tête d’épingle.

reddot A sa base, il y a une zone de complémentarité de 9 acides aminésqui lui confère sa forme d’épingle.La partie en rose correspond à la zone de complémentarité avec leproduit de PCR.

reddot La balise moléculaire est constituée de 33 nucléotides. La sonde est couplée du coté 5’ à un fluorochrome Reporter, et du coté 3’ à un flurochrome Quencher.

reddot De part sa forme en tête d’épingle, la balise met en rapprochement le Reporter et le Quencher. C’est pourquoi quand le Reporter reçoit une lumière qui correspond à sa longueur d’onde d’excitation, il la transmet au Quencher qui l’absorbe et l’on obtient pas de fluorescence.

reddot Lorsque la balise sera mise en présence des produits de PCR (Fig 2), elle va se greffer sur les brins d’ADN par complémentarité et va donc changer de conformation.En effet, sa nouvelle forme va faire que le Reporter va se retrouver éloigné du Quencher et va donc pouvoir émettre une fluorescence. Sur chaque produit de PCR reconnu, il y aura une balise qui émettra de la lumière. Et donc la quantité de produit de PCR correspond à l’intensité de fluorescence.

Fig 2 : appariement de la balise avec le brin d’ADN.

reddot Cette méthode permet donc de quantifier avec précision le nombre de transcrits.Une fois, le taux de fluorescence obtenu, celui-ci est reporté sur une courbe standard (Fig3) qui permet de déterminer le nombre de transcrits.

Fig 3 : Courbes représentant l’intensité de fluorescence d’un produit de PCR (X) comparé à
des courbes étalons. Ici, le nombre de transcrits BCR-ABL est d’environ 40000.

 

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Last Updated August 31, 2015 10:02 PM | admin news